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雙色預染超低分子量蛋白質Marker（1.5-42 kD）             

Dualcolor Prestained Ultra Low Molecular Weight Protein Marker（1.5-42 kD）

Ver.750354-2.0

● 儲存、運輸及效期：

  -20℃保存；濕冰運輸；有效期1年。

● 貯存緩沖液：

62.5 mM Tris, pH7.5, 2 mM EDTA, 2 % (w/v) SDS, 33 % (w/v) Glycerol, 5 mM DTT。

● 產品簡介：

    本產品由7種多肽和蛋白質組成，其中4.5 kD為紅色，其余條帶為藍色條帶，分子量大小為 ~1.5 kD，~4.5 kD（紅色），~7 kD， ~14 kD，~21 kD， ~28 kD，~42 kD?？梢杂糜谥苯佑^察蛋白質電泳狀況以及清晰地判斷Western Blot的轉膜效果。經Tricine-甘油SDS-PAGE凝膠電泳時以及轉移到PVDF或NC膜上可看到清晰的7條顏色條帶。

以每次上樣5 μl計算，該產品可以使用10次。

● 使用說明：

1. 第一次收到該產品，常溫溶化后，徹底混勻，離心快甩10 Sec將溶液完全收集到管底，-20℃貯存；

2. 使用該產品時，常溫解凍后輕輕混勻后既能使用，不能95℃加熱處理。；

一. 制膠：

多肽電泳建議使用Tris-Tricine-SDS-PAGE系統(tǒng)來分離蛋白，該系統(tǒng)可以分離1-100 kD的蛋白質（最優(yōu)分離2.5-30 kD）?？蛻艨梢允褂肨ris-Tricine-SDS-PAGE凝膠快速制備及電泳試劑盒

（含預染Marker）（貨號：RTD6121）或Tris-Tricine-PAGE凝膠制備及電泳試劑盒（多肽變性電泳）（貨號：RTD6122）進行Tricine電泳，方便快捷?；蛘吒鶕韵鲁绦蛑苽淠z，先配制分離

膠，聚合后再配制夾層膠，最后配制濃縮膠，3種膠的制膠體積比約為4.5:1.5:1.5。

1.1 配制分離膠：

1.1.1 按照表一將不同體積的分離膠組份加入到小燒杯中混合。

表一  （一塊1 mm 厚度小板膠用量）

注：如非必須，不要使用1.5mm厚度的凝膠，這樣會減少電泳后染色和脫色的時間。

1.1.2 加入10%APS和TEMED，立即混勻以使溶液混勻。

1.1.3 在玻璃板中灌入分離膠溶液，然后輕輕覆蓋一層1-3 cm的無水乙醇，使凝膠表面保持平整。

1.1.4 靜置10-20分鐘，待分離膠和乙醇層之間出現(xiàn)一個清晰的界面表示凝膠已聚合。

注：凝膠的聚合時間與環(huán)境溫度有關。夏天溫度較高時，聚合較快；冬天氣溫低時，聚合時間會延長。分離膠37℃約10分鐘，25℃約15分鐘，18℃ 約20分鐘可以聚合。

1.2 配制夾層膠：

1.2.1 去除覆蓋在分離膠上的醇，用濾紙將殘留的醇吸去。

1.2.2 按照表一將不同體積的夾層膠組份加入到小燒杯中混合。

1.2.3 加入10%APS和TEMED，立即混勻使溶液混勻。

1.2.4 在玻璃板中灌入適量夾層膠溶液，使液面和短玻璃板上沿之間的距離比梳齒長0.5 cm即可，然后在溶液上輕輕覆蓋一層1-3cm的無水乙醇，使凝膠表面保持平整。注：此溶液為過量，請勿全部注入，保留制備濃縮膠的位置。

1.2.5 靜置20-30分鐘，待夾層膠和乙醇層之間出現(xiàn)一個清晰的界面表示凝膠已聚合。

注：凝膠的聚合時間與環(huán)境溫度有關。夏天溫度較高時，聚合較快；冬天氣溫低時，聚合時間會延長。夾層膠37℃ 20分鐘，25℃ 25分鐘，18℃ 約30分鐘可以聚合。

1.3 配制濃縮膠

1.3.1 去除覆蓋在夾層膠上的乙醇，用濾紙將殘留的醇吸去。

1.3.2 按照表一將不同體積的濃縮膠組份加入到小燒杯中混合。

1.3.3 加入10%APS和TEMED，立即混勻，以使溶液充分混勻。

1.3.4 將梳子插入凝膠內，避免產生氣泡。

1.3.5 靜置20-40分鐘裝待凝膠聚合。

注：凝膠的聚合時間與環(huán)境溫度有關。夏天溫度較高時，聚合較快；冬天氣溫低時，聚合時間

會延長。濃縮膠37℃ 20分鐘，25℃ 30分鐘，18℃ 40分鐘可以聚合。

二. 電泳：

2.1 電泳緩沖液配制：

  電泳前，將10×陽極緩沖液（Cat No:AB080）和10×陰極緩沖液（Cat No:CB010）用蒸餾水稀釋成1×緩沖液備用。

2.2 樣品處理：

  待上樣的檢測樣品與2×Tricine上樣緩沖液(Cat:TP050)等體積混合，95℃處理5分鐘后上樣。雙色預染超低分子量蛋白質Marker（1.5-42 kD）混勻后直接上樣，不能加熱處理。

2.3 電泳：

  將電泳槽的外槽加入1×陽極緩沖液，內槽加入1×陰極緩沖液，輕柔拔出梳子，將Marker或蛋白樣品加入點樣孔，穩(wěn)壓電泳（電泳條件參考下表）

三. 凝膠檢測：

3.1 凝膠染色（FastBlue蛋白染色液）：

3.1.1將電泳后的PAGE膠取下放入塑料容器中,用適量蒸餾水漂洗，去除膠表面的SDS，殘余SDS會導致染色液出現(xiàn)沉淀。

3.1.2 棄水，加入適量染色液（以剛剛覆蓋過膠面為適)，搖床上常溫搖動，根據下表確定染色時間。

3. 1.3 搖床上搖動至所有條帶清晰可見。

3. 1.4 蒸餾水搖動漂洗脫色1-2次，每次5-10分鐘，至凝膠背景干凈。

3. 1.5 收集用過的染色液，可以重復使用2-3次。

凝膠也可以使用常規(guī)考馬斯亮藍染色液（配方7）和脫色液（配方8）進行染色和觀察。需要注意的是，常規(guī)染色和脫色方法需要較長時間，小肽由于長度較短，和凝膠結合不緊密，長時間在

溶液中浸泡容易從凝膠中脫離。FastBlue蛋白染色液（貨號：RTD6202）除具有染色快，無毒，靈敏性高等特點外，還能對小肽在染色中起到固定作用，不至于小肽在染色和脫色中從凝膠中脫離，是常規(guī)染色液的理想替代品。

3.2 轉膜：

多肽電泳后轉膜選擇孔徑0.22 μm PVDF膜（用前用甲醇處理潤濕）或0.22 μm NC膜。

3.2.1 半干轉：使用伯樂Trans-Blot Turbo半干轉機器請選擇配套的5×RealBlot快速半干轉轉膜緩沖液（貨號：RT5030），推薦轉膜條件:一板小型凝膠(8×10 cm)恒流,1.3 A,10-15 min。

3.2.1 濕轉：濕轉轉膜緩沖液(25 mM Tris,192 mM Glycine, 0.01%SDS，20% Methanol,pH~8.3），可以選擇10×Tris-甘氨酸轉膜緩沖液（貨號：TB1040）。推薦轉膜條件：恒流200 mA  40-60 min。

四.小分子蛋白質SDS-PAGE電泳試劑配制：

五.實驗示例：

多肽電泳配套試劑